De regreso a España en 1526 realizó una comisión en Lisboa. Nuevamente en Nicaragua, fue Alcalde de la ciudad de León y jefe de la Guardia en 1527. Ese año su antiguo jefe Pedrarias asumió la Gobernación y conspiró contra de Soto apoyando a su rival Castañeda. En 1530 fue nuevamente elegido Alcalde de León pero Pedrarias no le permitió ejercer el cargo.Entonces de Soto pretendió la conquista del Perú y se puso al habla con Sebastián de Benalcázar y el Licenciado Castañeda, mientras negociaba con Pedrarias, al tiempo que su socio Ponce veía la construcción de dos navíos. El Piloto Bartolomé Ruiz le había ennoveleriado con esa aventura, pero al final se entendió con Francisco Pizarro, que le ofreció una buena encomienda y el "cargo de Teniente de Gobernador en el pueblo más principal", a cambio de los dos navíos de Soto, que ya estaban en Panamá cargados de esclavos.

Hecho el trato, Pizarro se adelantó al sur mientras de Soto regresaba a Nicaragua por bastimentos y gente. Encontrados el 1o. de Diciembre de 1531 en la isla Puna, de Soto se desilusionó al comprobar que el segundo de la expedición no era él sino Hernando Pizarro, pero siguió adelante.

Como Jefe de la Vangaurdia fue el primero en desembarcar en Túmbez y Pizarro le envío con sesenta caballos a recorrer la tierra. De Soto se adelantó hasta Cajas y regresó con algunos tejos de oro recogidos a los indios del camino y la noticia de que la tierra era abundante en oro. Luego estuvo con Pizarro en la fundación de San Miguel de Piura en el sitio de Tangarara y de allí pasaron a Cajamarca donde otra vez se volvió a adelantar con veinticuatro jinetes para entrevistar al Inca Atahualpa, que descansaba de una herida en las termas cercanas. Desde el primer momento De Soto tomó simpatía a Atahualpa y fue bien correspondido, siendo el primer español que le trató.

Tras la sorpresa y captura del Inca, se convirtió en su mejor amigo y hasta le enseñó a jugar al ajedrez. Cuando se realizó el consejo para juzgar la conducta de Atahualpa, votó en contra de su condena a muerte. Pizarro, que nunca le había perdido la desconfianza porque le creía capaz de conquistar el Perú por su cuenta, le envío a una misión exploratoria, para saber si existía algún ejército enemigo en las cercanías, mientras asesinaba a Atahualpa con el garrote vil.

A su regreso De Soto comprobó la muerte de su amigo, pero al mismo tiempo recibió la suma fabulosa de 724 marcos de plata y 17.740 pesos de oro por su participación en el rescate del Inca.

De allí en adelante fue enviado al Cusco y al llegar a Vilcaconga sostuvo un reñidísimo encuentro con tropas enemigas, que casi le costó la vida. Pizarro aprovechó para acusarle de haberse adelantado más de lo ordenado.

En 1534 asistió a la fundación española del Cusco y recibió lo prometido por Pizarro, pues le designaron Teniente Gobernador y recibió una de las mejores encomiendas. Enseguida comandó las tropas que lucharon contra Quisquís, que aún resistía. El 35 pretendió conquistar Chile pero Pizarro prefirió dar esa misión a Diego de Almagro. Quizo servir de Capitán General y también fue relegado, pues Pizarro prefirió a Rodrigo Ordóñez.

Impedido de seguir prosperando en el Perú viajó a España ese año y contrajo matrimonio con Isabel de Bobadilla, una de las hijas de su antiguo jefe Pedrarias Dávila. Tenía una mas que regular fortuna y se instaló en una mansión sevillana a vivir de las rentas y a lo gran señor, pues acababa de cumplir cuarenta años, edad suficiente para ver las cosas de la manera más real.

En 1537 solicitó la Gobernación de Quito y luego la de Guatemala, pero el 38 a instancias de Francisco Vázquez de Coronado, que le fue expresamente a visitar, pidió al Rey que le permitiera conquistar las tierras de la Florida. Hechas las capitulaciones con Carlos V, fue nombrado Gobernador de Cuba con sede en La Habana, Adelantado Mayor de la Florida y demás tierras que descubriere y conquistare y el derecho a titularse Marqués de esas zonas. Igualmente se le permitían sacar hasta 1.000 hombres de España y sus respectivos bastimentos. El título de Caballero de la Orden de Santaigo también le fue conferido.

Con tan buenos auspicios vendió sus bienes y embarcó a Cuba con su esposa y gente el 6 de Abril de 1538. Una vez en La Habana se enteró que el Virrey de Nueva España Hurtado de Mendoza también preparaba una expedición y no se preocupó por ello, pues en el nuevo mundo lo que más sobraba eran tierras. Así pues, el 12 de Mayo de 1539 zarpó en once naves hacia la Florida y durante los siguientes tres años anduvo primero con rumbo norte hasta el actual estado de Georgia y luego con destino suroeste por las comarcas de Alabama hasta topar en Mayo del 41 con el gran río Mississipi, que recorrió en su trecho inferior sin encontrar las fabulosas riquezas que buscaba.

Tan largo caminar en medio de tribus hostiles y salvajes, que constantemente acechaban la oportunidad de atacarles, terminó por hacer desfallecer el ánimo de los más reacios soldados. Solo Hernando de Soto seguía impertérrito pensando que a esas tierras debería llamar "Nueva Extremadura" en recuerdo a su comarca natal, pero unas fiebres extrañas comenzaron a consumirle y murió cerca del gran río que había descubierto, siendo sepultado en su lecho, para evitar que los indios Natchez lo ultrajaran.

Después sus hombres iniciaron el lento regreso al mar pero solo llegaron trescientos soldados que más parecían espectros, pues los restantes setecientos habían perdido la vida en esas inmensidades de Norteamérica.

De Soto fue un soldado valiente y gentil y un hombre culto y de buen corazón. Con las damas afectuoso y viril, en el Perú tuvo como principal amante a la Princesa Tocto Chimbu, hija de Huayna Cápac y luego a la princesa Cusicoillor, hija predilecta de Huáscar, cuando quedó viuda del príncipe Quilaco de los Quitus y esto solamente porque estaba en el deber de protegerla como amigo que había sido de Quilaco. No dejó hijos, pero si una hija llamada María de Soto, posiblemente mestiza, a quien menciona en su testamento de 1539, que casó en el Perú con el español Hernán Nieto.